CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DO SISTEMA CRISPR/CAS EM GENOMAS DE CITROBACTER FREUNDII E STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

Resumo

O locus CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) corresponde a uma família de DNA repetitivo presente no genoma de bactérias e arqueas. Este locus é formado por Repetições Diretas (DR), regularmente separadas por sequências nomeadas espaçadores, correspondentes a fragmentos genéticos exógenos. Associado ao locus estão os genes Cas, os quais codificam as proteínas Cas, com função de helicases, polimerases e nucleases. Essas duas estruturas formam o sistema CRISPR/Cas, correspondente a um mecanismo adaptativo e imunológico de resistência bacteriana. Este sistema já foi identificado em várias bactérias de importância médica, como Escherichia coli, Salmonella sp., Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii. Considerando as bactérias gram positivas de importância clínica, poucos estudos foram realizados com espécies Citrobacter freundii e Streptococcus pneumoniae. Nesse contexto, a presente pesquisa teve como objetivo investigar a presença e estrutura do sistema CRISPR/Cas em genomas de Citrobacter Freundii e Streptococcus pneumoniae. Os genomas de Citrobacter Freundii e Streptococcus pneumoniae foram obtidos na plataforma do GenBank e analisadas a partir de ferramentas computacionais específicas para a identificação do locus CRISPR. A ferramenta online para identificação do sistema CRISPR/Cas foi o CRISPRFinder; BLASTp e Uniprot foram empregados para confirmação dos genes Cas. A ferramenta BLAST CRISPRdb e BLASTn do NCBI foram aplicadas para investigação dos espaçadores. O CRISPRTarget e BLASTn do NCBI foram utilizados para identificação da origem dos espaçadores. Dentre os 50 genomas de Streptococcus pneumoniae analisados, nenhum apresentou o sistema CRISPR/Cas, não houve a identificação dos locus CRISPR nem genes Cas. Em contrapartida, dentre os 100 genomas de Citrobacter freundii observados, 4 deles (cf2, cf23, cf32 e cf89) apresentaram o sistema CRISPR/Cas, verificando-se, respectivamente, uma frequência de 4% do sistema nestes genomas. Nos genomas cf2, cf32 e cf89 foram identificados apenas um locus, enquanto que no genoma cf23, observou-se a presença de dois locus, e todos apresentaram, tamanho, número de DRs e espaçadores diferentes. Em todos os isolados positivos para o sistema foram identificados os genes Cas 1, Cas 2, Cas 3, Cas 5, Cas 6 e Cas 7, o que possibilitou a classificação dos sistemas CRISPR/Cas identificados nos genomas como tipo 1. Os locus encontrados nos isolados apresentaram tamanhos variáveis, possuindo de 1251 a 2469 pb (pares de base), com número de DRs e espaçadores distintos. Foram encontradas repetições degeneradas e mutações apenas nos genomas cf 23, cf 32 e cf 89, cujas sequências apresentavam 29 pb. Dentre os 141 espaçadores identificados nos locus, 43 apresentaram similaridade com outras sequências depositadas nos bancos de dados, incluindo genomas bacterianos, virais e fagos. Mediante os dados obtidos, pode-se afirmar que a frequência do sistema CRISPR em genomas de Citrobacter freundii é baixa, porém, a presença deste sistema pode refletir interações com outras espécies bacterianas e possível veiculação dos locus entre genomas. Nesse cenário, ressalta-se a necessidade de estudos adicionais, visando a identificação e caracterização deste sistema em outros genomas de C. freundii, bem como em outras espécies bacterianas, possibilitando análises comparativas e possíveis relações com a resistência bacteriana aos antimicrobianos.